本项目的研究目的是通过对油茶饼粕中茶皂素、茶多酚的提取纯化及成分分析为基础，研究茶皂素的溶血性对福寿螺的室内毒杀效果，茶多酚抗氧化活性，以及日粮添加油茶多酚对芦丁鸡产蛋性能、蛋中茶多酚富集和蛋品质的影响。对油茶饼粕作为生物灭螺剂和动物饲料方面的前景提供基础，具有重要的研究价值。

①采用单因素正交实验法优化提取油茶饼粕中的茶皂素和茶多酚，并用大孔树脂对其分离纯化；

②油茶饼粕皂素对福寿螺室内毒杀试验；

③通过ORAC法检测油茶多酚的抗氧化活性，固相萃取-高效液相色谱法检测茶多酚的组成；

④日粮添加油茶多酚对芦丁鸡产蛋性能、蛋中茶多酚富集和蛋品质的影响。

具体实验方案：

1、油茶饼粕总酚含量的测定

采用福林酚比色法检测油茶饼粕总酚含量。

称取25 mg没食子酸标准品于250 mL容量瓶中定容。吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚显色剂，摇匀后加入2 mL质量分数15%的碳酸钠溶液，定容，室温下反应2 h后，测A₇₆₀，绘制标准曲线。

将油茶饼粕干燥粉碎过60目筛，取0.5 mL稀释适当浓度后的提取液于10 mL容量瓶中，记录稀释因子，加入1 mL福林酪显色剂，摇匀，加入2 mL的15%碳酸钠溶液，定容，室湿下反应２ｈ，测A₇₆₀，据标准曲线方程计算没食子酸含量。   

2、油茶饼粕茶皂素含量的测定

采用香草醛-浓硫酸比色法检测油茶饼粕茶皂素含量。准确称取油茶皂苷标准品 100.0 mg，用 80％乙醇溶液溶于50 mL容量瓶中，定容、摇匀，即得标准溶液。分别取油茶皂苷标准溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，加甲醇定容至0.5 mL，加入8%香草醛溶液0.5 mL，于冰水浴中加入质量分数 77％硫酸溶液4 mL，以试剂为空白，摇匀，于60 ℃下加热15 min，置于冰水浴中冷却10 min，取出放置室温下，测A₄₅₂，绘制标准曲线。

取油茶饼粕皂素提取样液0.5 mL加入8%香草醛溶液 0.5 mL，于冰水浴中加入质量分数 77％硫酸溶液4 mL，摇匀，于60 ℃下加热15 min，置于冰水浴中冷却10 min，测A₄₅₂，根据标准曲线方程计算皂苷含量。

3、单因素正交法优化超声提取油茶饼粕皂素和多酚实验

精确称取5 g（±0.01 g）油茶饼粕粉末，加入试验量料液比的提取液在超声清洗机中高温萃取。以提取液浓度（0%，20%，40%，60%，80%，100%）、料液比（1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30）、超声温度（30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃）、超声时间（0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h）为单因素，油茶饼粕皂素含量和总酚含量为指标，考察各因素对油茶饼粕皂素和多酚提取效果的影响。

根据单因素试验结果，设计四因素三水平正交试验，确定最优提取油茶皂素和多酚的工艺条件。

4、分离纯化油茶饼粕皂素和多酚

大孔树脂预处理：乙醇浸泡LX-60型大孔树脂至加水洗涤至不浑浊；再用质量分数5% NaOH水溶液浸泡，水洗至中性；最后用质量分数5% HCl水溶液浸泡，水洗至中性。

将预处理后的树脂放入吸附柱中，提取液沿吸附柱上端缓慢上样，吸附后，用蒸馏水除杂（提取液体积的1~5倍），用乙醇溶液梯度洗脱（20%~80%），收集洗脱液，浓缩，干燥。油茶多酚和茶皂素分别富集在质量分数为20%~40%的乙醇溶液和40%~80%的乙醇溶液中，从而实现油茶多酚与茶皂素的分离。

5、油茶饼粕皂素对福寿螺室内毒杀试验

放养大、中、小福寿螺各10个，共30只于30×30×30 cm水族箱中，加入0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%的茶皂素水溶液，并设清水为对照，加入深度3 cm，试验温度为常温。在处理后24 、48 h观察和记录福寿螺的存活与死亡数量情况，统计死亡率。

按Abbott公式计算校正死亡率, 然后查死亡率的机率值，求毒力回归方程及 LC₅₀值，对毒力回归方程进行方差分析，并测定 LC₅₀ 95%的置信区间。

6、油茶饼粕多酚抗氧化活性的检测

    采用ORAC法对油茶饼舶提取物的抗氧化活性检测与评价。移取20 μL样品或对照、空白、Trolox标准物质溶液、其中一个孔加入40 μL PBS溶液（阳性对照），分别加入黑色96孔板中，在酶标仪37℃下解育20 min；每孔加入200μL荧光素钠溶液，盖上微孔板，37℃孵育20 min，确保在测样品之前酶标仪升温至37℃。每个孔内加入20 μL ABAP溶液（除了加40μL ABAP的孔）启动反应，迅速测量96孔板。酶标仪的测定条件为：激发波长485 nm，发射波长535 nm，每周期前震荡时间8 s、震荡宽度4 mm，测试周期为35。

曲线下面积计算如下：

AUC＝（0.5*f₁/f₁₊f₂/f₁₊f₃/f_1+…+f_i/f_1+…+f₃₄/f₁+0.5*f₃₅/f₁）×CT

式中：

f₁——第一个周期的荧光数据；

fi——第i个周期的巧光数据；

CT——周期时间，min。

扣除空白样的AUC就得到曲线交叉面积（the net AUC）。最终ORAC值由

Trolox浓度和the net AUC表现为一个线性回归方程。这个线性回归方程用于测

量浓度6.25~50 μmol Tolox/L之间。

ORAC值用线性方程y=ax+b（y—Net AUC；x—Trolox浓度）来计算。

7、固相萃取-高效液相色谱法检测油茶饼粕多酚的组成

固相萃取：将油茶饼粕多酚提取液用C18固相微萃取小柱纯化，用Waters SPE真空提取装置，每次可同时处理20个样，小柱活化和样品预分离的流速均为10 mL/min，小柱用30 mL甲醇活化，后用30 mL超纯水洗尽残留甲醇，样液过柱后色素，蜡质等弱极性物质保留在小柱上，而多酚类物质在该流动相条件下在小柱上不保留，可简便快速的达到纯化多酥样品的目的。

HPLC测定油茶饼粕提取物中的8种多酚物质：测定8种多酚物质分别为没食子酸、槲皮素、儿茶素、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸醋（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸醋（EGCG）、芦丁。测定时的液相条件：C18色谱柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm）；流动相为0. 1%磷酸水溶液:甲醇（V:V)= 68:32；流速为0. 9 mL /min；柱温为 25 ℃；检测波长为 279 nm；进样量为15 μL。

8、日粮添加油茶多酚对蛋鸡产蛋性能、蛋中茶多酚富集和蛋品质的影响

随机选取26周龄体重相近、健康的芦丁鸡，分为6组，每组10只，室内箱养，自由采食和饮水。1 组为对照组，饲喂基础日粮，第2~6组分别在基础日粮中添加0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%的油茶饼粕多酚。预试期3 d，正试期28 d。

在试验第7，14，28天，根据各组鸡产蛋情况随机采集鸡蛋，用于测定多酚含量及蛋品质。由于试验后期高浓度组( 1. 8% TP 组)产蛋数量可能有所降低，因此需根据实际产蛋数量进行蛋品质指标与活性物质含量的检测分析。检测前，鸡蛋于 4℃ 贮藏，备用。

产蛋量的测定：在为期 28 d 的正式试验期间，统计各组第1~7，8～14，15～28天这3个阶段的各组日平均产蛋量。

蛋中多酚富集效果的测定：样品的前处理依照《出口食品中TP的检测方法高效液相色谱法》（SN/T 3848-2014），并作适当改动。称取2 g蛋黄/蛋清样品置10 mL带刻度离心管中，加入甲醇定容至10 mL，混匀，旋涡振荡2 min；超声20 min；置-20 ℃ 冰箱中冷冻10 min；5 000 r/min离心8 min；取上清液，用0. 45 μm有机微孔滤膜过滤，滤液供高效液相色谱仪检测用。测定时的液相条件：C18色谱柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm）；流动相为0. 1%磷酸水溶液:甲醇（V:V)= 68:32；流速为0. 9 mL /min；柱温为 25 ℃；检测波长为 279 nm；进样量为15 μL。鸡蛋品质的检测：包括蛋重、蛋黄重、蛋清重、蛋壳重、蛋壳颜色、蛋形指数、 相对密度、蛋黄颜色、哈氏单位、蛋壳厚度。

油茶（Camellia oleifera Abel.）属于山茶科植物，为常绿小乔木，在我国广泛种植，是农业生产中重要的木本油料作物^[1]。油茶饼粕是指油茶果去壳压榨后除油以外的剩余物，油茶粕中含有有粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、茶皂素、茶多酚、茶多糖、灰分、 单宁、咖啡碱等成分。油茶饼粕在日常生产中往往被直接丢弃，造成了资源浪费，有效提取和应用油茶饼粕生物活性成分，可以实现油茶饼粕回收和再利用，提高油茶饼粕的利用率^[2]。张耀洲^[3]等以油茶饼粕为原料，采用乙醇提取—丙酮沉淀法对茶皂素进行提取分离。结果表明: 体积分数95%的乙醇，液料比为 9:1（mL:g），提取温度70℃，提取时间4 h，提取次数2次，提取液浓缩至刚好有固体析出，丙酮用量为4倍浓缩液体积量时提取分离效果较佳，得到的茶皂素纯度为85.17% ，得率为9.82%。谢阳娇^[4]等研究了用丙酮提取油茶饼粕中的多酚物质，并进行了单因素实验和正交实验来优化提取条件，料液比1:5、提取液浓度60%、提取温度为50℃、提取时间0.5 h达到最优提取效果，提取率高达3.217±0.153％。

油茶皂素具有亲水性的糖体和疏水性的皂苷元，是一种天然非离子型表面活性剂，具有乳化、分散、湿润、发泡等表面活性作用以及抗渗、消炎、镇痛等药理功能，并且有灭菌杀虫和刺激某些植物生长的功能，因而广泛应用于日化、农

药、食品及医药等领域^[5-10]。温华良^[11]等研究了油茶饼粕对不同螺龄的福寿螺毒杀试验，结果表明油茶饼粕、五水硫酸铜原药、农用碳酸氢铵对福寿螺都有一定的毒杀作用，其中油茶饼粕对福寿螺的防效最佳，药后24 h，15 d螺龄的福寿螺死亡率高达76.7％，药后48 h防效达100％。娄丽娟^[12]等采用茶籽饼防止稻田福寿螺，通过室内容器茶籽饼浓度试验和稻田及沟渠茶籽饼灭螺示范发现，茶籽饼能快速有效地杀死福寿螺，且对水稻生长安全，故可选用茶籽饼作为杀灭稻田福寿螺的首选药剂。

油茶多酚具有强抗氧化活性，单体抗氧化能力不如溶剂提取物混合物强，改性后，也可进一步提高其抗氧化活性^[13]。吴佳敏^[14]等研究过茶多酶及其衍生物都能够有效的抑制脂肪的过氧化，且油茶多酚的安全性较高，并且茶多酚的改性衍生物的抗氧化活性更好。多酚作为一类出色的天然抗氧化剂，对其保健功能的研究一直是国内外研究的热点之一。茶多酚具有很好的保健作用，市面上已经有很多茶多酌保健产品^[15]。在与人类疾病的对抗中，自由基作为一个常见的问题备受重视，它与许多疾病的发生发展都有重要关系，而抗氧化剂作为有效对抗自由基的一种手段发挥着重要的作用^[16-17]。ORAC—氧自由基吸收能力，也被称为抗氧化能力指数，是目前普遍被接受的一个抗氧化能力评价手段。Miller和Rice Evans等^[18]报道的TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）方法基于测定抗氧化物ABTS+方法原理对ABTS+自由基的清除能力，结果表达为当量Trolox值。由于方法简单，其已被用来测定食物样品和化合物的抗氧化活性。ORAC法在此基础上加以改良，是目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为简单、准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一^[19]。油茶饼粕多酚类物质具有抗肿瘤、抗突变、预防龋齿等多种药效，已成为一类重要的食品添加剂和药物，因此对油茶饼粕样品中多酚测定具有重要意义^[20]。目前植物多酪的测定方法主要有光度法和色谱法，其中高效液相色谱分析法是最有效的方法之一^[21]。而油茶饼粕提取液中含有色素蜡质等杂质，在对样品进行液相分析前需分离提纯。近年来固相萃取这项纯化技术已在有机分析中得到广泛应用。

目前油茶饼粕在农业中主要应用于种植业和养殖业。其种植业应用现状体现在土壤改良和食用菌种植方面。养殖业应用价值体现在制备家禽饲料方面。由于油茶饼粕的成分中含有皂素这一溶血物质，并且还富含涩味物质单宁，所以用于饲时，需对油茶饼粕进行有机脱毒^[22]。国内有研究人员采取粉碎、干燥、浸提等处理方法对油茶饼粕进行脱毒处理，然后将脱毒后的残渣与基础日粮进行搭配，用于猪饲养。此外还有报道提出油茶饼粕通过提取茶皂苷以及油脂之后，在保证油茶饼粕茶皂苷含量在1%之内的情况下，基本不会出现辣味和涩味，从而不会对鸡、猪等家禽家畜进食产生影响^[23]。油茶饼粕中多酚物质作为动物饲料可以清除动物体内产生的活性氧自由基，保护机体细胞免受损害，具有保护心脏、抗癌和降血脂等作用^[24-26]。此外，多酚类物质可以通过改变肌肉组织中脂肪酸的分布，即提高多不饱和脂肪酸含量、降低饱和脂肪酸含量，而改善肉品 质，增加肌肉组织的氧化稳定性^[27]。油茶饼粕多酚通过提高家禽肠道的抗氧化功能，来改善家禽健康状况，从而提高其生长性能和蛋品质^[28]。范真真^[29]等研究了日粮添加不同浓度茶多酚对芦花鸡中多酚的富集、蛋品质及产蛋量的影响。研究表明日粮添加1.8%TP组蛋黄中EGCG含量显著高于对照组及0.2%、0.6%TP 组（P＜0. 05），且第14天1.8%TP 组蛋黄中EGCG含量最高，为33.278 μg /g。 7，14 天，1. 8%TP 组蛋清中EGCG含量显著高于对照组和其他各水平TP组（P＜0. 05）；第28天，1.4%和1.8%TP组蛋清中EGCG含量显著高于其他各水平TP 组（P＜0. 05），且1. 8%TP 组蛋清中EGCG含量最高，为30.79 μg/g。

在全国大力推广油茶种植的情况下，中国茶油及其副产物产量明显增加，为降低生物资源浪费、增加油茶副产物利用率，提高油茶附加值成为科研人员所关注的热点问题。但目前关于油茶饼粕中活性物质及功能因子的相关研究相对较少。油茶粕作为原料应用于农业的加工与研发、并将油茶粕功能活性成分应用于医疗保健方向是未来的研究热点。

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我国是油茶树种植最多的国家，拥有油茶林面积达到400 hm²，每年产油茶粹130万吨、油茶副产品——油茶饼粕70万吨。由于油茶饼粕具有溶血作用，导致对其加工利用具有很大的局限性。油茶饼粕活性成分中茶皂素和茶多酚是近年来的热点，但研究主要针对有效成分的提取，对其实际应用于农业中的研究报道较少。油茶饼粕皂素有良好的药用价值，具有溶血、消炎、祛痰、抗真菌、抗突变的作用，可用作杀菌剂、杀虫剂、利尿剂等。福寿螺是首批入侵我国的 16种“危害最大的外来物种”之一，本项目利用油茶饼粕皂素对福寿螺进行毒杀试验，既可综合利用茶粕资源，且可有效控制外来检疫性生物福寿螺的迅速蔓延和危害。本项目还研究油茶饼粕在畜禽生产中作为绿色无公害饲料添加剂，据报道其具有促进动物生长、协同或替代抗生素（抗菌抗病毒）、提高饲料利用效率、农产品品质等作用，市场前景看好。

1、技术路线：

2、拟解决的问题：

a、探究油茶饼粕中茶皂素和茶多酚的优化提取条件；

b、通过大孔树脂分离纯化油茶饼粕提取物，将油茶皂素和油茶多酚制成粗成品；

c、检测油茶皂素的灭螺活性；

d、测定油茶多酚的抗氧化活性及其成分分析；

e、通过日粮添加油茶多酚，测量芦丁鸡产蛋率、鸡蛋多酚富集量和鸡蛋品质的变  

化。

3、预期成果

完成项目研究报告；在国内外期刊发表2篇论文。

2022年6月—2022年9月，查阅文献，结合实验室条件，筛选出油茶饼粕皂素和多酚的最佳提取工艺；

2022年10月—2022年12月，分离纯化油茶饼粕提取物中的茶皂素和茶多酚；检测油茶多酚的抗氧化活性；固相萃取-高效液相对油茶多酚进行成分分析；

2023年1月—2023年10月，油茶皂素的室内灭螺试验；检测芦丁鸡日粮添加油茶多酚后产蛋率、多酚富集量和蛋品质；

2023年11月—2024年4月，资料总结，数据处理与撰写论文和研究报告。